Karščio smūgio sukeltas vėlyvas pelių neurologinis deficitas, kurį sukelia baltosios medžiagos demielinizacija, Purkinje ląstelių degeneracija ir sinapsinis sutrikimas smegenyse

Šiame tyrime buvo naudojami C57 / BL6J pelių patinai (10 savaičių amžiaus). Visi gyvūnai buvo įsigyti iš SLC Japan Inc. (Šizuoka, Japonija). Pelėms buvo leista laisvai prieiti prie maisto ir vandens, jos buvo palaikomos 12 valandų šviesos / tamsos ciklu kambario temperatūroje (24 ± 2 ° C), esant pastoviai drėgmei (40 ± 15%). Visas eksperimentines procedūras, susijusias su gyvūnais ir klinikiniais duomenimis, patvirtino ir prižiūrėjo Showa universiteto Institucinis gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas (# 09022, 02003), kuris laikėsi ARRIVE gairių. Visi metodai buvo atlikti pagal atitinkamas gaires ir reglamentus.

Dalyvių gautas vaizdo įrašas apie klibėjimą po žmogaus šilumos smūgio ir galvos MRT pacientams, patyrusiems šilumos smūgį. Visus eksperimentinius protokolus patvirtino ir prižiūrėjo Showa universiteto klinikinių tyrimų peržiūros taryba (F2019C83), kuri laikėsi CIOMS biomedicininių tyrimų etikos gairių. Informuotas sutikimas buvo gautas iš visų dalyvių ir (arba) jų teisėtų globėjų. Tyrimai atlikti vadovaujantis Helsinkio deklaracijos principais.

Protokolas dėl karščio smūgio

Buvo naudojamas aukštas AT ir RH, panašus į vidutinio klimato / atogrąžų vasaras, šilumos smūgio modelis, kuris buvo pagrįstas mūsų ankstesniu tyrimu.19. Iš akrilo pagaminta pusiau uždara šilumos smūgio kamera (200 × 340 × 300 mm) buvo sukurta vertikaliai sudėjus gyvūnų narvus į šiltnamį primenančią konstrukciją. AT, RH ir WBGT drėkinimui ir stebėjimui buvo naudojamas ultragarsinis drėkintuvas (USB-68, Sanwa, Japonija) ir skaitmeninis termo-higrometras (AD-5696; CA&D Company, Japonija). Šilumos smūgio kamera buvo patalpinta į inkubatorių (Bio-chamber, BCP-120F; TITEC, Japonija) ir kaitinama iki norimos eksperimentinės temperatūros ≥ 3 valandas. Drėkintuvas buvo įjungtas likus 3 valandoms iki šilumos smūgio, kad būtų sukurta karšta ir drėgna aplinka. Tuo tarpu pelėms buvo leista 3 valandas apriboti vandenį, o šiek tiek dehidratuotos pelės buvo patalpintos į šilumos smūgio kamerą ir 60 minučių veikiamos aukšta AT (41 ° C) ir RH (> 99, 0%). Vėliau jie buvo grąžinti į gyvūnų narvą, kur galėjo gauti maisto ir vandens. Pelės, kurios nebuvo veikiamos karščiu, buvo naudojamos kaip kontrolė (CTL grupė).

Elgesio tyrimas (rotarod testas)

Rotarod testas buvo atliktas pagal ankstesnę ataskaitą34. Rotarod bėgimo takelis (Muromachi Kikai, Japonija) sudarytas iš plastikinio strypo (skersmuo, 3 cm; ilgis, 10 cm), kurį supa keturios didelės apvalios plokštės (skersmuo 57 cm). Strypas pradžioje sukasi pastoviu 4 aps./min greičiu ir 5 min nuolat greitėja iki 40 aps./min. Buvo išmatuotas laikas, kiek kiekviena pelė praleido ant strypo. Pelės buvo treniruojamos su rotarod testu kartą per savaitę penkis kartus prieš karščio smūgį. Pelės elgesio testas buvo atliktas du kartus per 5 minutes ir buvo išreikštas kaip bandymų vidurkis. Gyvūnai buvo suskirstyti į dvi grupes (HS ir CTL) pagal paskutinio mokymo balus (n = 36 kiekvienoje grupėje). HS grupės pelės buvo kaitinamos 1 val. CTL grupės (be HE) pelės buvo paruoštos kaip kontrolė. HS ir CTL grupėms buvo atlikti elgesio testai praėjus 1, 3, 5, 7 ir 9 savaitėms po šilumos smūgio (papildomas S2a pav.).

Audinių paruošimas

Taikant natrio pentobarbitalio (50 mg / kg, ip) anesteziją, pelėms (HS, n = 9, kiekvienoje grupėje) praėjus 1, 3 ir 9 savaitėms po šilumos smūgio, buvo perfuzuojama 0,9% natrio chlorido tirpalu. 10% neutralizuoto formalino. Smegenys buvo pašalintos ir padalintos į dvi dalis išilgai išilginio smegenų plyšio. Paruošti parafinu įterpti dešiniojo smegenų pusrutulio mėginiai. Vėliau aštuonios sagitalinės sekcijos buvo supjaustytos 5 μm storiu kas 200 μm intervalu nuo smegenų išilginio plyšio histologiniam tyrimui, kaip aprašyta toliau. Amžius atitinkančios CTL grupės pelės buvo paruoštos pašalinti senėjimo įtaką (papildomas S2b pav.).

Pusiau kiekybinis smegenėlių baltosios medžiagos demielinizacijos įvertinimas

Smegenėlių baltosios medžiagos demielinizacija buvo tiriama KB metodu be Nissl dažymo33.35 val. Aštuonios sagitalinės smegenėlių pusrutulių sekcijos buvo paruoštos 200 µm intervalais 5 µm storiu, nudažytos KB. Šiose aštuoniose dalyse buvo nuskaitytas visas smegenėlių pusrutulis 400 kartų padidinus kiekvienoje pelėje, naudojant 9 gyvūnus per laiką. Luxol greito mėlynumo intensyvumas, kuris baltojoje medžiagoje nudažo mieliną (greitai mėlyną), buvo pusiau kiekybiškai įvertintas, kad būtų galima įvertinti demielinizaciją. Šios sritys buvo rankiniu būdu atsekamos apakintais tyrėjais ir paverstos juodai baltais; juodos sritys buvo pusiau kiekybiškai įvertintos naudojant „Scion Image for Windows“ („Scion Corporation“, JAV). Juodųjų mielinuotų sričių pikseliai buvo padalyti iš pikselių iš visų atsektų sričių ir išreikšti procentais. Kiekvienam gyvūnui buvo apskaičiuotos aštuonios sagitalinių sekcijų serijos. Šias procedūras atliko du tyrėjai (HY ir KY), kurie buvo apakinti eksperimentinėms grupėms.

Imunocheminis Purkinje ląstelių dažymas ir skaičiavimas

Kita serijinė aštuonių sagitalinių pjūvių serija buvo imuniniu būdu nudažyta antikūnais prieš kalbindiną D-28k (kalbindiną) ir naudojama Purkinje ląstelėms skaičiuoti.36. Pašalinus parafiną, naudojant ksileno/alkoholio tirpalų seriją, sekcijos buvo inkubuojamos 10 mM natrio citrato buferyje (pH = 5,0) 25 min., kad būtų gautas karščio sukeltas antigenas, ir panardintos į 0,3 % vandenilio peroksidą/metanolį 30 min. blokuoti endogeninę peroksidazės reakciją. Tada sekcijos buvo inkubuojamos su pelių Ig blokuojančiu reagentu (MOM; Vector, JAV), po to plaunama 5% ožkos serumu, kad sumažėtų pelės endogeninis imunoglobulinas ir nespecifinės reakcijos. Tada sekcijos buvo inkubuojamos per naktį su monokloniniu pelės anti-kalbindino antikūnu (1: 2000; Swant, Šveicarija) ir kitą dieną inkubuojamos 90 minučių su biotiniluotu ožkos anti-pelės IgG (1: 200, DAKO, CA, JAV). . Imunoreakcijos buvo vizualizuotos inkubuojant su avidino – biotino kompleksiniu tirpalu (Vector, JAV) ir diaminobenzidinu (Sigma, JAV). Kalbindinui imunopozityvios Purkinje ląstelės buvo nustatytos ir suskaičiuotos naudojant CellSens Standard programinę įrangą (Olympus, Japonija). Purkinje ląstelių skaičius smegenėlių molekuliniame sluoksnyje buvo skaičiuojamas du kartus rankiniu būdu visose tos pačios sekcijos skiltelėse ir apskaičiuotas vidurkis. Ląstelių skaičiavimas buvo pakartotas aštuoniose sagitalinėse dalyse. Tai taip pat atliko tyrėjas (HY ir KY), kuris buvo aklas eksperimentinėms grupėms.

Imuninis sinapsinių žymenų dažymas

Post- ir presinapsiniai žymenys buvo nudažyti smegenyse praėjus 1, 3 ir 9 savaitėms po šilumos smūgio, kad būtų galima įvertinti sinapsę aplink Purkinje ląsteles, naudojant keturias iš devynių pelių. Po karščio sukelto antigeno paėmimo ir blokavimo pagal aukščiau paminėtą protokolą, sekcijos buvo inkubuojamos su monokloniniu triušio anti-kalbindino antikūnu (1:100, Cell Signaling, JAV) arba polikloniniu triušio anti-sinaptofizino antikūnu (1:200, Proteintech, JAV) su monokloniniu pelės anti-postsinapsinio tankio 95 (PSD95) antikūnu (1: 400, BD, JAV) per naktį 4 ° C temperatūroje. Po plovimo sekcijos buvo inkubuojamos su Alexa 488 konjuguotu ožkos anti-triušio IgG antikūnu (1: 400; Thermo Fisher Scientific, JAV) ir Alexa 546 konjuguotu ožkos anti-pelės IgG antikūnu (1: 400; Invitrogen, JAV). Vėliau ląstelių branduoliai buvo nudažyti 4,6-diamidin-2-fenilindolo dihidrochloridu (1:10 000; Roche, Vokietija) ir inkubuoti 1,0 mM CuSO4 50 mM amonio acetato buferyje (pH = 5,0), kad sumažėtų autofluorescencija37.38. Fluorescencija buvo aptikta naudojant Axio Imager optinį pjūvių mikroskopą su ApoTome II (Carl Zeiss, Vokietija). Kontroliniam dažymui buvo atlikti tie patys veiksmai, išskyrus inkubaciją su pirminiais antikūnais.

Statistinė analizė

Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± standartinė vidurkio paklaida. Studentės t buvo atliktas dviejų grupių palyginimo testas. Daugkartiniam palyginimui buvo atlikta pakartotinė dispersijos analizė ir Tukey – Kramer testas. Statistinis reikšmingumas buvo nustatytas a P-vertė <0,05.

Etikos deklaracijos

Visas eksperimentines procedūras su gyvūnais patvirtino ir prižiūrėjo Showa universiteto Institucinis gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas, kuris laikėsi ARRIVE gairių. Visus žmonių tyrimų protokolus patvirtino ir prižiūrėjo Showa universiteto Klinikinių tyrimų peržiūros taryba, kuri laikėsi CIOMS etinių biomedicininių tyrimų gairių. Informuotas sutikimas buvo gautas iš visų dalyvių ir (arba) jų teisėtų globėjų. Tyrimas atliktas pagal Helsinkio deklaraciją.

Patvirtinimas eksperimentams su gyvūnais

Visas eksperimentines procedūras, susijusias su gyvūnais ir klinikiniais duomenimis, patvirtino ir prižiūrėjo Showa universiteto Institucinis gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas (# 09022, 02003), kuris laikėsi ARRIVE gairių.

Patvirtinimas eksperimentams su žmonėmis

Visus žmogaus tyrimų protokolus patvirtino ir prižiūrėjo Showa universiteto Klinikinių tyrimų peržiūros taryba (F2019C83), kuri laikėsi CIOMS biomedicininių tyrimų etikos gairių. Informuotas sutikimas buvo gautas iš visų dalyvių ir (arba) jų teisėtų globėjų. Tyrimai atlikti vadovaujantis Helsinkio deklaracijos principais.

Parašykite komentarą

El. pašto adresas nebus skelbiamas.