Kupranugarių IFN gali atlikti svarbų vaidmenį kovojant su naujais zoonoziniais patogenais

Study: Beta interferons from the extant camelids: Unique among eutherian mammals. Image Credit: Rita_Kochmarjova / Shutterstock

Per pastaruosius du dešimtmečius trijų didelio patogeniškumo zoonozinės kilmės koronavirusų atsiradimas ir pasaulinis poveikis privertė greitai atkreipti dėmesį į antropogeninius ligos evoliucijos veiksnius ir galimų būsimų zoonozių protrūkių prevenciją. Daugybė zoonozinių virusų gali sukelti kitą pandemiją po sunkios ūminio kvėpavimo sindromo koronaviruso 2 (SARS-CoV-2) pandemijos.

Kupranugariai yra vieninteliai išgyvenę žinduolių pobūris Tylopoda, kuris pirmą kartą pasirodė prieš 40 milijonų metų. Camelidae yra puikiai prisitaikiusių gyvūnų šeima, gyvenanti tam tikrose ekologinėse nišose, kuriose yra atšiauri temperatūra, mažai lapijos, maisto ir vandens. Camelini (senojo pasaulio kupranugariai) susideda tik iš vienos genties ir dviejų rūšių. Lama (Lama glama), Gvanakas (Lama guanicoe), Vicugna (Vicugna vicugna) ir alpaka (Alpakos vikunja) yra keturios Lamini (Naujojo pasaulio kupranugarių) rūšys. Camelidae šeima pasižymi nepaprastu išsaugojimo lygiu, visi išlikę individai turi tą patį chromosomų skaičių ir turi skirtingus sunkiosios grandinės antikūnus.

Neseniai paskelbtame tyrime Vystymosi ir lyginamoji imunologija žurnale, aprašomas naujos žinduolių interferono-beta (IFN-β) formos su keturiomis cisteino liekanomis iš dromedaro kupranugario ir penkių likusių žinduolių pobūrio Tylopoda narių atradimas. Užsikrėtus kupranugarių raupų virusu ir stimuliavus viruso mimikos poli, buvo ištirta IFN-β mRNR ekspresija.

Į in vitro, rekombinantinis dromedaras IFN-β, sukurtas prokariotinėje ekspresijos sistemoje, padidino į IFN reaguojančių genų ekspresiją kupranugarių inkstų ląstelėse ir suteikė antivirusinį atsparumą kupranugarių raupų virusui. Numatoma, kad kupranugarių IFN bus svarbūs kovojant su naujomis kupranugarių zoonozinėmis ligomis.

Tyrimas: Beta interferonai iš išlikusių kupranugarių: unikalus tarp euterinių žinduolių. Vaizdo kreditas: Rita_Kochmarjova / Shutterstock

Išvados

Autoriai sukūrė polimerazės grandininės reakcijos (PCR) pradmenis aplink galimą IFNB geną koduojančią sritį. Naudodami CdIFNbNF ir CdIFNbNR pradmenis, jie klonavo ir sekvenavo 646 bazinių porų (bp) fragmentą iš dromedinio kupranugario genominės DNR. Klonuotame fragmente rastas 561 bp atviras skaitymo rėmelis (ORF), koduojantis 186 aminorūgščių baltymą. Įrodyta, kad dromedaras kupranugaris IFN-β, lyginant su kitais žinduolių modeliais, yra vienodas su kiaulių (83,2 %), žmonių (77,4 %) ir pelių (62 %) ortologais.

Autoriai amplifikavo ir klonavo 1274 bp fragmentą iš DraI suardytos genominės DNR bibliotekos, naudodami genų vaikščiojimą. IFNB CDS buvo 108 bp ilgio, o 5 ‘reguliavimo sritis buvo 1166 bp ilgio, prieš srovę nuo pradžios kodono. TATA dėžutė buvo aptikta 110 kilobazių (kb) prieš starto kodoną šiame aukštupio reguliavimo regione. Į virusus reaguojantys elementai (VRE), kuriuose yra visi keturi teigiami reguliavimo domenai (PRD) I, II, III ir IV, taip pat buvo aptikti kupranugario IFNB promotoriaus srityje prieš TATA dėžutę.

Norint ekspresuoti baltymą kaip N-galinį His6 pažymėtą baltymą, subrendusią baltymą koduojanti dromedaro IFN seka buvo klonuota į pET28a vektorių. Brandaus IFN baltymo kodavimo seka apima šešiolika E.coli nedažni kodonai, galintys slopinti rekombinantinę E.coli ekspresiją. Norėdami padidinti ribotų neįprastų kodonų skaičių, autoriai atliko rekombinantinę ekspresiją tiek BL21, tiek Rosetta 2 E.coli kuriame buvo plazmidė. Naudojant nedažną kodonų papildymą, rekombinantinis baltymas buvo geriau ekspresuojamas Rosetta 2 padermėje. E.coli.

Nors inkliuziniai kūnai generavo daugiausiai rekombinantinių baltymų, buvo nustatyta, kad rekombinantinis baltymas yra funkciškai inertiškas po gryninimo ir in vitro perlankstymas. Dėl to autoriai naudojo žemesnę temperatūrą, kad sukeltų rekombinantinį baltymą Rosetta2 E.coli. Be to, autoriai naudojo afininę chromatografiją, kad gautų išgrynintą baltymą, kuris buvo patvirtintas Western blot metodu prieš jį naudojant in vitro tyrimais, nors baltymų kiekis, išreikštas mėginio ekstrakte, buvo mažesnis net indukuojant žemoje temperatūroje.

Autoriai naudojo Camelpox virusą (CMLV) ir kupranugarių inkstų ląstelių linijas, kad išbandytų antivirusinį dromedaro IFN-β veiksmingumą. in vitro. IFN-β apdorotos ląstelės buvo atsparios CMLV infekcijai. Lyginant su kontroliniu baltymu apdorotomis arba neapdorotomis kontrolinėmis ląstelėmis, užkrėstomis CLMV, IFN-β ir IFN-α1 apdorotos ląstelės neturėjo citopatinio poveikio. Jie naudojo realaus laiko qPCR, kad įvertintų CMLV DNR sumažėjimą po gydymo IFN-β, kad išmatuotų antivirusinį aktyvumą. Palyginti su neapdorotomis ląstelėmis arba ląstelėmis, apdorotomis His6 pažymėtu kontroliniu baltymu, ląstelės, iš anksto apdorotos IFN-β, turėjo mažiau CMLV DNR.

Pasekmės

IFNB genas buvo klonuotas ir identifikuotas šiame tyrime iš dromedaro kupranugario ir visų kitų esamų Camelidae narių. Kupranugarių IFN-β yra vienintelis euterinis žinduolis, kurio brandžiuose baltymuose yra dvi poros cisteinų. Antivirusinis atsparumas kupranugarių raupų viruso citopatiniam poveikiui buvo nustatytas kupranugarių inkstų ląstelėse, apdorotose prokariotiškai sukurtu rekombinantiniu dromedaru IFN-β. IFN-β iš šios skirtingos žinduolių kohortos padės suprasti antivirusinio imuniteto mechanizmus ir sukurti antivirusinius vaistus nuo ligų, kurios gali sukelti kitą zoonozinę pandemiją.

.

Parašykite komentarą

El. pašto adresas nebus skelbiamas.