SARS-CoV-2 Mpro inhibitoriai, sukurti ant barškuoklių nuodų pastolių

Study: Design of D-Amino Acids SARS-CoV-2 Main Protease Inhibitors Using the Cationic Peptide from Rattlesnake Venom as a Scaffold. Image Credit: Kateryna Kon/Shutterstock

Sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo koronaviruso 2 (SARS-CoV-2) atsiradimas 2020 m. gruodžio mėn. lėmė pasaulinį 2019 m. koronavirusinės ligos (COVID-19) protrūkį, kuris 2022 m. balandžio mėn. pareikalavo daugiau nei 6,2 mln.

Tyrimas: D-amino rūgščių SARS-CoV-2 pagrindinių proteazės inhibitorių projektavimas, naudojant barškuoklių nuodų katijoninį peptidą kaip pastolius. Vaizdo kreditas: Kateryna Kon / Shutterstock

Buvo tikimasi, kad vakcinų kūrimas padės slopinti viruso plitimą, tačiau abejonės dėl vakcinos ir imuninės sistemos pabėgimo variantų paneigė šią viltį.

Tai suteikė naują postūmį ieškant naujų arba pakartotinai pritaikytų antivirusinių vaistų, veikiančių prieš šį virusą.

Naujas straipsnis, kuris pasirodo žurnale Farmacijos produktaiaprašomas naujų molekulių, slopinančių viruso pagrindinį proteazės (Mpro) fermentą, kūrimas, pagrįstas barškučių nuodais.

Įvadas

Antivirusinio vaisto paieška apima poreikį užtikrinti, kad junginys būtų saugus, gerai toleruojamas ir gali veikti prieš naujus viruso variantus. Ankstesni antivirusiniai vaistai, tokie kaip remdesiviras, favipiraviras ir lopinaviro/ritonaviro derinys, nebuvo labai veiksmingi prieš SARS-CoV-2 realiame pasaulyje.

Užkrėtęs šeimininko ląstelę, SARS-CoV-2 iš savo ribonukleino rūgšties (RNR) genomo gamina du didelius poliproteinus. Vėliau viruso Mpro ir kitos virusinės proteazės juos suskaido į daugybę nestruktūrinių baltymų, kad palengvintų replikaciją ir transkripciją. Tai galiausiai paskatins naujų virionų gamybą, surinkimą ir išleidimą.

Mpro, dar vadinamas 3CLpro, yra cisteino proteazė, egzistuojanti homodimerinės formos su nekanonine katalizine cisteino-histidino (Cys-His) diada plyšyje tarp dviejų iš trijų domenų. Šis fermentas neturi artimų žmogaus homologų ir yra būtinas viruso gyvavimo ciklui. Dėl to jis yra geras pasirinkimas antivirusiniams vaistams.

Antimikrobiniai peptidai (AMP) buvo gausus potencialių vaistų, skirtų kovai su virusais ir kitais patogeniniais mikrobais, šaltinis. AMP naudojami kelioms su virusais susijusioms ligoms, pvz., Zika, Dengės karštligei ir A gripui, gydyti. Vienas iš tokių yra krotaminas.

Krotaminas yra mažas polipeptidas, randamas Pietų Amerikos barškučio nuoduose, Crotalus durissus terrificus. Šis peptidas gali prasiskverbti pro ląstelės sienelę ir yra labai biologiškai aktyvus, daugiausia dėl jo katijoninių paviršiaus savybių. Jis ypač būdingas greitai besidauginančių ląstelių atakai ir yra naujų į ląsteles prasiskverbiančių polipeptidų (CPP) nanonešiklių kategorijos dalis.

Kaip ir kiti CPP, jis patenka į tikslinių ląstelių tipus per 5 minutes. Šiame tyrime buvo tiriama maža peptidų seka Crot_27–39 (krotamino darinys L-peptidas-1, L-CDP1) ir jo D dariniai dėl jų slopinančių savybių prieš SARS-CoV-2 Mpro.

Pirmajame modifikacijų rinkinyje cisteino liekanos buvo paverstos serino likučiais kitose vietose. Kadangi cisteino likučius sunku pakeisti visiškai nepakeitus baltymų sudėties, o cisteinas primena seriną visuose, išskyrus vieną atomą, jie pakeitė tik cisteino tiolio grupę. Taip buvo išsaugotas visas krotamino katijoninis krūvis, taigi ir galimybė prasiskverbti į ląsteles keičiant membraną.

Išvados

Nustatyta, kad L-CDP1 ir jo modifikacijos, tokios kaip L-CDP2, L-CDP7 ir L-CDP8 peptidai, slopina daugiau nei 80% Mpro aktyvumo priklausomai nuo dozės. Nors krotaminas visiškai slopino fermentą, kai koncentracija buvo 300 µM, o pusė didžiausios slopinančios koncentracijos (IC50) buvo 40 µM, L-CDP1 sukėlė visišką slopinimą esant 30 µM, kai IC50 buvo > 2 µM.

L-CDP2, kur visi cisteinai buvo pakeisti serinu, o IC50 padidėjo iki 5 µM. Kai cisteinas yra 36 padėtyje, pakeitimas sukelia LCDP-7 susidarymą, kuris yra veiksmingesnis slopinant. L-CDP-7 ir L-CDP-8 IC50 buvo 1,5 µM, o visiškas slopinimas esant 60 µM.

Tolesnė analizė parodė, kad pakeitus cisteiną atsiranda konformacinių pokyčių. Nustatyta, kad trys pagrindiniai inhibitoriai, būtent L-CDP1, L-CDP7 ir L-CDP8 peptidai, yra konkurencingi inhibitoriai, sąveikaujantys su aminorūgštimis katalizės vietoje arba substrato surišimo vietoje, kad blokuotų patekimą į substratas į aktyvią vietą.

Didžiausias Mpro surišimo veiksmingumas buvo pastebėtas naudojant L-CDP1 receptorių. Cisteino pakeitimas serinu lėmė sieros grupės praradimą ir hidroksilo grupės padidėjimą, pakeisdama antrinę baltymo struktūrą ir jo sąveiką su proteaze. Taigi cisteino liekana yra raktas į peptido patekimą į ląstelę ir Mpro slopinimą.

D-enantiomerai, susidarę siekiant išvengti šių peptidų skilimo endogeniniais fermentais, yra mažiau imunogeniški ir labiau biologiškai prieinami nei L formos. Jų IC50 vertės šiek tiek padidėjo, tačiau jie sukėlė tokį patį konkurencinį slopinimą kaip ir L formos. D-CDP1 ir D-CDP7 IC50 vertės buvo atitinkamai 5 ir 2 µM.

Svarbu tai, kad nepastebėta jokių sterinių kliūčių. Be to, D-CDP1 sąveikauja su Mpro maždaug dešimt kartų stipriau nei D-CDP7, kaip ir su L formos. Šie junginiai nepasižymėjo agregacija pagrįstu slopinimu ir laikui bėgant išliko stabilūs, sukeldami pastovų fermento slopinimą 24 valandas.

Nė vienas iš D-enantiomerų nebuvo citotoksinis esant IC50 vertėms. In vitro tyrimai parodė, kad abu slopino SARS-CoV-2 replikaciją ląstelių kultūroje, todėl viruso RNR sumažėjo dvigubai. Tai nėra kliniškai reikšminga, bet rodo, kad šie junginiai turi antivirusinį aktyvumą užkrėstose ląstelėse, konkrečiai slopindami viruso replikaciją.

Šių junginių struktūrinio vaizdavimo analizė parodė, kad serino pakeitimas cisteinu keičia peptidų ir fermento sąveiką, nes cisteinas sudaro vandenilio ryšius su triptofanu peptide, kuris iš dalies yra atsakingas už jo antrinę struktūrą. Šios L-CDP1 liekanos atitinka fermento rišamąsias kišenes.

Naudojant L-CDP7, kitos triptofano liekanos ir toliau dalyvauja jungiantis kitose vietose, parodydamos, kad pirminė S2 vieta teikia pirmenybę aromatinėms aminorūgštims. Abu šie junginiai gerai įsiliejo į Mpro fermento surišimo vietą.

Pasekmės

Atliekant junginių, gautų iš barškuoklių nuodų, atranka atskleidė katijoninius peptidus, pasižyminčius didelėmis ląstelių prasiskverbimo savybėmis. Kaip D-enantiomerai, jie yra labai stabilūs, selektyvūs ir specifiniai Mpro fermentui.

Reikės atlikti tolesnius tyrimus, siekiant patvirtinti, kad šių junginių veikimo vieta iš tikrųjų yra Mpro fermentas, kaip jie veikia ir optimali kiekvieno peptido sudėtis. Dėl to gali būti sukurti terapiniai junginiai nuo SARS-CoV-2 ir susijusių koronavirusų.

.

Parašykite komentarą

El. pašto adresas nebus skelbiamas.